CRISPR牛誕生。間違いなく男の子

子牛の出産が遅れていた。出産予定日の3月30日は過ぎていた。アリソン・ヴァン・イーネンナームは当初、雄の子牛は1日か2日遅れる傾向があるからだろうと考えていた。週が経つにつれ、動物遺伝学者の彼女は、遺伝子編集された胚（この9ヶ月間、Cow 3113号の体内で育っていたもののような）は、代理母に出産準備が整ったことを知らせるのに少し時間がかかることを思い出した。しかし、翌週、カリフォルニア大学デービス校のビーフバーンで2度の誤報が鳴り、陣痛の兆候がまだ見られない中、ヴァン・イーネンナームの神経は限界に達した。彼女は獣医に電話した。いよいよ陣痛を誘発する時が来た。

5年近くの研究、少なくとも50万ドルの費用、数十回の妊娠失敗、そして数え切れないほどの科学的挫折を経て、牛肉業界のニーズに合わせたCRISPR遺伝子組み換え牛の系統を作ろうとするファン・イーネンナーム氏の先駆的な試みは、この一頭の子牛に集約された。そして、幸運にも、その子牛は世界的なパンデミックの真っ只中にこの世に誕生しようとしていたのだ。

ほんの数週間前、カリフォルニア州知事は、致死性の新型コロナウイルスの感染拡大を防ぐため、州全体に自宅待機を命じていた。これは、米国で最初の市中感染例が発見されたことを受けたものだった。患者は、ビーフバーンから約32キロ離れたカリフォルニア大学デービス校医療センターで治療を受けた。ベイエリアの集中治療室のベッドは埋まりつつあった。ファン・イーネンナームは、出産がうまくいかず帝王切開が必要になったらどうなるかを心配していた。獣医師たちは、人工呼吸器を装着する（人間の）新型コロナウイルス感染症患者の需要増加に対応するため、鎮静剤を温存するよう求められていた。そして、それだけでは不吉なだけでなく、その日出産に立ち会った獣医研修医は、夜中にコヨーテに襲われたカリフォルニア大学デービス校の羊数頭を午前中に安楽死させていた。

「このプロジェクトの進み具合を考えれば、本当にこれとは全く違う結末にはならなかったでしょう」と、ファン・エネナームはオーストラリア訛りの口調に、不安げな皮肉を交えて言った。「まるで黙示録の三人の騎士が彼のすぐ後ろをついてくるような感じですね」

実際にはそうではありませんでした。子牛はその日の午後にやって来ました。体重は110ポンド（約45kg）、後ろの蹄の上に足首をかすめる程度の白い斑点がある以外は真っ黒でした。獣医2人が鎖を使って牛3113号から子牛を引き出しましたが、藁が敷かれた納屋に降ろされた時には、子牛は生きていて呼吸していました。「コスモォォォォォォ」とファン・エネナームは勝ち誇ったように叫びました。「ようこそ、この世界へ、小さな子！」

空は暗くならず、世界は終わらなかった。しかし、黒い子牛は大きく、強く、健康ではあったものの、科学者たちが作り出そうとしていたものとは完全には異なっていた。そのDNAを詳しく調べれば、Crisprによる遺伝子編集がいかに予測不可能であるか、そしてこの技術が動物の繁殖に日常的に用いられるようになるまで、科学者たちがまだどれほど多くのことを学ばなければならないかが明らかになるだろう。

ジョーイ・オーウェンは、もともと動物好きではなかった。生化学を専攻し、その後がん遺伝学を学んだ後、2014年にヴァン・イーネンナームの家畜研究室に飛び込んだ。彼らのような科学者にとって、希望に満ちた時代だった。Crisprのゲノム工学の可能性が発見されたのは、わずか2年前のことだった。ある種から別の種に遺伝子を移植することなく、デザイナー家畜を作れる可能性が開かれたのだ。従来の遺伝子工学技術は、ウイルスやバクテリアを使ってDNAを輸送する必要があり、米国の規制当局による高額で長期にわたる承認プロセスが必要だった。その結果、アメリカの農家や牧場主はこれまで、家畜の遺伝子を改良するために、着実に進歩を続ける品種改良技術に頼るしかなかった。Crisprは、この状況を変える可能性を秘めていた。

ファン・エネナームは牛とSRYと呼ばれる遺伝子に着目していた。SRYはY染色体上の長い領域で、哺乳類の胚に雄の形質を発達させるよう指示する。自然界では、牛（そして人間も）が雄（XY）または雌（XX）の子を産む確率は等しくある。しかし、もし彼女がCrisprを使って牛の胚のX染色体にSRYのコピーを追加できれば、確率を歪めて雄だけの群れを作り出すことができる。SRY遺伝子を持つ動物は、遺伝的にはXXであっても、生理学的には雄になる。いずれにせよ、それが彼女が検証したかった仮説だった。これまで誰もそれを検証したことがなかったのだ。

牛肉業界では、牛の体格と肉質を重視するため、雄牛の数が増えれば利益も増え、品質も向上する。雄の子牛は雌牛よりも効率的に体重を増やすため、農家はより少ない頭数で同じ量の牛肉を生産でき、ひいては地球温暖化の原因となる排出量を削減できる可能性がある。ファン・イーネンナーム氏がこの概念を実証できれば、他の雌だけの種、つまり雌だけの産卵鶏や乳牛の群れを作り出す道が開かれるかもしれない。そして最終的には、より残酷でない工業的食料生産システムにつながると彼女は考えている。

しかし、彼女とオーウェンが米国農務省に提案した実験は、信じられないほど野心的なものでした。牛の胚に非常に大きなDNA断片を挿入する必要がありました。農務省（USDA）にバイオテクノロジーリスク評価助成金を申請した時点では、Crisprを用いた同様の編集は牛の細胞では2回しか行われておらず、胚で行われたことは一度もありませんでした。それでも、農務省は5年間で50万ドルの助成金を交付しました。「USDAが私たちのプロジェクトに資金を提供してくれたとき、私たちは『え、本当？』と思いました」とオーウェンは振り返ります。そして最初から、ほとんど何も計画通りには進みませんでした。

最初のステップは、Crisprを使って牛の胚に望み通りの編集を行わせることでした。Crisprは本質的にプログラム可能な分子メスです。ゲノムの特定の場所を標的とし、DNAの二重らせん構造を切り裂くことで機能します。そして、細胞自身の修復機構が、切断されたDNAを再びつなぎ合わせます。これらの断片の間に新たな遺伝コードを追加したい場合は、細胞の「鋳型DNA」（この場合はSRY遺伝子のコピー）をCrisprの構成要素と一緒に挿入することが鍵となります。

このアプローチは活発に分裂している細胞で最も効果的です。しかし、単細胞胚ではそうはいかないことをオーウェンはすぐに知りました。「何がくっつくかを知るために、あらゆる方法を試しました」と彼は言います。「何もうまくいきませんでした。」

そこで彼らは、あまり好まれていない古い手法、つまり牛の細胞を編集し、そのDNAを卵子にクローン化するという手法をやり直した。（ほぼ同時期に、中国の研究グループがこの手法を用いて、結核耐性遺伝子を牛にCrisprで組み込むことに成功していた。）このプロセスを容易にするため、オーウェンはSRY遺伝子に加えて緑色蛍光タンパク質（GFP）の遺伝子も追加した。これにより、どの細胞がX染色体に男性化の遺伝子を挿入できたかを視覚化できる。すると彼は奇妙なことに気づいた。新しいDNAを取り込んだ細胞、つまり光る細胞はすべて分裂を停止したのだ。編集によって細胞の発生が停止していたのだ。

実験開始当初、研究者たちはX染色体のある部分を標的としていた。それはジャンクDNAの領域にあり、生命維持に不可欠な遺伝子からは程遠いように見えた。しかし、当時彼らが利用できたウシゲノムの地図は、10年以上前に作成された粗い地図だけだった。2018年春に公開された最新のウシゲノムでは、オーウェンのチームがSRY遺伝子を、本来であれば細胞の成長に不可欠な遺伝子から1万塩基対離れた位置に挿入するはずだったが、実際には真ん中に挿入していたことが明らかになった。

彼らは Crispr システムを再設計し、更新されたマップを使用して編集が必須遺伝子を避けるようにしました。次に、それを再び胚で試しました。今回はうまくいきました。しかし、このときすでに 2018 年の夏であり、ほぼ 3 年が経過していました。プロジェクトは大幅に遅れていました。彼らは USDA に助成金の延長を申請しなければなりませんでした。長く続いた挫折のせいで、オーウェンはかなり落胆し、クリスプリン牛の飼育に挑戦しなければよかったと思っていました。最近、X 染色体の新しい位置で胚の編集に成功したことで彼は元気を取り戻しましたが、その気分も長くは続きませんでした。編集した胚の最初のバッチを代理母となる雌牛の子宮に移植しましたが、うまくいきませんでした。次のバッチでは、5 つの胚が着床して妊娠初期まで進みましたが、数週間後に失われました。

オーウェンとファン・エネナームは、ブリーダーや獣医師に相談し、何が間違っていたのかを突き止めました。研究者たちは、研究室で胚を損傷したのではないかと疑っていました。おそらく、生検の際に胚のごく一部を採取し、ゲノム配列を解析して編集が効いているかどうかを確認したのでしょう。この作業には時間がかかり、ゲノム解析室から結果が返ってくるまで胚を凍結保存する必要があります。凍結、生検、編集という各ステップが、胚の生存率を低下させてしまうのです。

もっと簡単な方法があった。蛍光を発する遺伝子を再び胚に取り付け、紫外線を照射するのだ。緑色に光れば編集が成功したことがわかり、生検や凍結は不要だ。しかし、そうすると動物は遺伝子組み換えになってしまう。GFPはワシントン州沖に生息する発光クラゲの一種に由来する。つまり、遺伝子組み換え生物（GMO）となり、FDAの厳格な承認手続きが必要となる。このプロジェクトとCrisprの使用の目的は、まさにこれを回避することにあった。

しかし、彼らが試行錯誤している間に、規制の状況は変化した。2017年1月、FDAは編集された動物のDNAを新種の医薬品として分類することを決定した。つまり、Crispr技術を用いた雄だけの牛の群れは、第一世代のGMOと同じ規制の対象となるということだ。そして、連邦政府の目から見れば、牛のDNAを移動させることはクラゲの遺伝子を追加することと同じだとしたら、彼らの生活を少し楽にしてあげてもいいのではないかと研究チームは考えた。牛の飼育者や営利企業がSRYノックインに関心を示し、わざわざ連邦政府と揉めるとは思えない状況では、研究者たちは光る遺伝子の開発を進めた方が賢明だろう。

ファン・イーネンナームとオーウェンは最後にもう一度試み、SRY遺伝子を光る遺伝子とともに約200個の胚に移した。これが最後のチャンスだったので、彼らはこれまで試みていたX染色体ではなく、17番染色体上の確立されたセーフハーバー部位に編集を行うことに決めた。この過程を生き残った胚は22個で、そのうち9個が紫外線の下できらめいた。しかし、全身が明るい緑色だったのはそのうちの1個だけだったとオーウェンは話す。そして、すべての胚を雌牛に移植してから1か月後、その明るい緑色の胚だけが妊娠を維持した。研究チームは、2000年代半ばに放映されたニコロデオンのテレビアニメシリーズ「フェアリーテイル・オッド・ペアレンツ」に出てくる緑色の光るキャラクターにちなんで、成長中の子牛をコスモと名付けることにした。 「私は明らかに団塊の世代なので、そのことを聞いたことがありませんでした」とヴァン・イーネンナーム氏は言う。

超音波検査の結果、コスモはオスであることが示唆されました。そして4月7日にコスモが生まれた時、獣医は子牛の呼吸を確認した後、次にそのオスを確認しました。「はい、睾丸が2つあります！」と獣医はヴァン・イーネンナームとオーウェンに言いました。「表現型的にはオス。良いスタートですね！」

しかし、コスモが男性器を持っているのが Crispr のせいかどうかを知るには、コスモの DNA を調べる必要があった。研究チームは子牛の首から血液を数本採取し、オーウェンはそれを急いで研究室に運び、冷蔵庫に入れて 16 時間のクールダウンを開始した。彼は家に帰り、焦燥感を鎮めるためにビールを数本飲み、翌朝 6 時半に目覚ましをセットした。午前 5 時、彼はぱっと目が覚め、まだ暗いうちに研究室へ急いだ。オーウェンは子牛の血液から DNA を抽出し、PCR ゲル電気泳動法と呼ばれる技術を使用して、余分な SRY 遺伝子と GFP 遺伝子の存在を調べた。約 4 時間後、バンドがまさに予想された場所に現れたとき、高揚感の衝撃が彼の体を駆け巡った。「すごい、本当にやったんだ！」と彼は心の中で思った。

オーウェンは周囲を見回し、静かな機器に囲まれたこの瞬間を味わった。パンデミックの影響で、研究室には一度に一人しか入れなかった。同僚たちは皆、自宅待機をしていた。そこでオーウェンはゲルの写真を撮り、チームにメールで送った。

寝室兼ホームオフィスで、ヴァン・エネナームはメールをクリックした。もっと悪い知らせだろうと覚悟していた。ところが、実際には勝利の喜びが彼女を包み込んだ。「やったー！」と彼女は叫び、拳を突き上げたのを覚えている。

ゲルの結果は完全なホームランではなかった。コスモがXYであることが明らかになった。つまり、彼は実父からSRY遺伝子のコピーを受け継いでおり、さらにオーウェンが17番染色体にCrisprで導入したSRY遺伝子も受け継いでいたのだ。編集をしなくても、コスモは必ずオスになるはずだった。しかし、ノックインは成功し、ウシの胚にCrisprを用いたのは史上初だった。「この結果が出たのは本当に嬉しかった」とヴァン・イーネンナームは言う。「まさに最高の科学体験の日だった」

しかし、コスモのDNAを最初に素早くスキャンした時に、別の何かが浮かび上がってきた。それは牛やクラゲではなく、細菌の遺伝子コードだった。SRY遺伝子は数千のDNA塩基配列からなる巨大な遺伝子であり、コスモとなる単細胞胚に挿入するために、オーウェンは科学者が知る唯一の方法、つまりプラスミドと呼ばれる細菌の環状DNA片に挿入して細胞内に送り込まなければならなかった。Crisprが切断した後、コスモの修復酵素がSRY遺伝子と共にプラスミドを捕捉し、そのままゲノムに組み込んだのだ。

このようなミスは過去にも発生しています。昨年、ミネソタ州に拠点を置くバイオテクノロジー企業Recombinetics社が、クローン編集細胞を卵子に移植する手法を用いて作製した、遺伝子操作によって角を切除された雄牛2頭から、同様のプラスミドが発見されました。ヴァン・イーネンナーム氏は、Recombinetics社の雄牛とその子孫を対象に、遺伝子改変が意図したとおりに受け継がれているかどうかを調査するため、米国農務省（USDA）から資金提供を受けました。このプラスミドは、FDAの科学者が、その子孫の一部から採取したDNA配列データを分析した際に発見されました。

リコンビネティクス社の科学者たちは、プラスミドの存在を一度も調べていませんでした。このような細菌DNAが動物やその肉に悪影響を及ぼすことは示されていませんが、多くの国では遺伝子組み換え作物（GMO）として再定義され、より厳しい規制の対象となる可能性があります。この事実発覚により、同社はブラジルで雄牛の精液から実験用の牛群を育成する計画を頓挫させました。小規模ながらも成長を続ける家畜編集産業にとって、これは大きな打撃となりました。

しかし、こうした潜在的な問題への認識を高めることには成功しました。そこで、ヴァン・イーネンナームのチームはコスモのDNAを深く掘り下げる計画を事前に立てていました。しかし、それもパンデミックによって複雑化しました。カリフォルニア大学デービス校のシーケンシング・コアが停止したのです。そこでチームは、コスモの血液、組織、胎盤の一部を2つの異なる企業に送り、彼の真の構成要素を解明しようとしました。すると、返ってきたものは予想以上に奇妙なものでした。

Crispr は想定通りに切断を行った。しかし、その後さらに切断を行った。そのため、ヴァン・イーネナームとオーウェンが SRY と GFP をそれぞれ 1 つずつ貼り付ける予定だった場所では、状況がはるかに乱雑になった。17 番染色体の片方の腕では、新しい DNA がまったく定着しなかった。細胞はギャップを埋めるために 26 個の DNA 文字をランダムに拾い上げた (これは、細胞が二本鎖 DNA 切断を修復する方法としてはごく普通のことだ)。実際の動作が起こったのはもう一方の腕だった。約 90 パーセントの細胞では、7 つの SRY と GFP のコピーが挿入されていた。そのうち 2 つは逆向きに挿入されていた。そして、細菌のプラスミドもそこにあった。約 10 パーセントの細胞では、3 つの (正しい向きの) SRY-GFP 構築物と 1 つのプラスミドが存在していた。

どのように繋ぎ合わせたにせよ、SRYは大量に存在する。さらに、コスモのY染色体にもコピーがあった。それは彼が父親から受け継いだものだ。「彼はとても男らしい男なんです」とヴァン・エネナームは言う。これらの重複は意図したものではなかったが、今のところコスモに悪影響は出ていないようだと彼女は言う。「彼が存在しているという事実は、必要以上にSRYのコピーを持っていても死に至るわけではないことを示しています」と彼女は言う。

SRY遺伝子の過剰コピーを持つマウスの研究では、変異が動物に害を及ぼすという証拠は見つかっていないものの、XX個体では不妊症を引き起こす可能性がある。それでも、コスモポリタン社のSRY遺伝子の大量発生は、まさにCrispr批判派が遺伝子編集のリスクに関して懸念する予期せぬ結果と言えるだろう。近年、海外では、デザイナー家畜の市場投入を目指した実験が行われており、ウサギの舌肥大、椎骨過剰ブタ、牛の早死など、奇妙な副作用が報告されている。ハーバード大学医学部の動物生命倫理学者リサ・モーゼス氏は、これらの報道が出た当時、ウォール・ストリート・ジャーナル紙に対し、「自分たちが何をしているのか分かっていて、どんな悪いことが起こり得るかを予測できると考えるのは、実に傲慢だ」と語っている。

カリフォルニア大学バークレー校イノベーティブ・ゲノミクス研究所の遺伝子編集専門家、フョードル・ウルノフ氏は、カリフォルニア大学デービス校の研究には関わっていないが、ファン・エネナーム氏のような先駆的な実験が最初から完璧にうまくいくと期待するのは非現実的だと述べている。「彼らは胚における遺伝子編集を用いた標的統合によって雄牛を作ろうと試み、実際に成功したのです」と彼は言う。それは完璧な編集だったのか？いいえ。この分野が絶望的に​​なったという意味か？決してそうではないと彼は言う。「これらの問題を克服する方法はありますが、問題が存在することを認識するまでは解決できません。」

SRYの本当の効果を正確に知るには、何年もかけて綿密に研究する必要がある。しかしカリフォルニア大学デービス校の研究チームは、コスモのゲノムの初期解析結果を木曜朝、アメリカ動物学会のポスター発表で公表した。結果をレビューしたキャンベラのオーストラリア国立大学の遺伝学者ガエタン・バージオ氏は、完璧とは言えない結果に驚きはしていないという。彼の研究グループでは、マウスDNAに新しい遺伝子を追加し、ヒト疾患の研究のための新しいモデルを作るのに日常的にCrisprを使用している。複数コピーや望ましくないプラスミド挿入は非常に一般的だと彼は言う。「マウスではこれをたくさん見てきました」と彼は言う。細胞が細菌DNAの複数コピーを取り込むことがある。バージオ氏は1匹の動物で最大70コピーを見たことがある。「Crisprを使ってノックインを行うのはまさに悪夢です」と彼は言う。

この混乱はすべて、遺伝子編集酵素の動態に起因していると、彼は言う。DNAをきれいに二つに切断すると、結果を制御するのは困難だ。しかし、Crispr遺伝子編集研究の初期、ファン・エネナーム氏が雄牛のみのプロジェクトを開始した当時、科学者たちはこのことを実際には認識していなかった。誤った挿入やその他の望ましくない変化の報告がマウスで見られるようになったのは、2017年後半頃だったと、バージオ氏は言う。

比較的新しいCrispr構造の中には、DNAに切り込みを入れるだけで不要な挿入の機会を制限することで、こうしたミスを回避しているものもあります。しかし、これらのシステムは他の点で不安定な場合が多く、ごく一部の細胞でしか機能しなかったり、想定外の編集を行ったりすることがあります。「結局のところ、完璧なツールは存在しないのです」とバージオ氏は言います。カリフォルニア大学デービス校チームの牛の実験の設計と分析は、彼にとって妥当なものに思えます。しかし、これはCrisprを用いて家畜のDNAを再設計するという科学がまだ非常に新しいものであることをさらに証明しています。「今のところ、動物の遺伝子編集を効率的にすることは得意ですが、安全にすることはまだ得意ではありません。いずれは実現できると思います。しかし、まだやるべきことはたくさん残っています」と彼は言います。

ファン・エネナーム氏にとって、その研究にはコスモを生殖成熟まで育て、来春に精液を採取し、次世代の子牛を産むことが含まれる。理論上、コスモは75%の子牛を雄にするはずで、これは通常の50%がY染色体を受け継ぎ、残りの25%が17番染色体にCRISPR法で導入されたSRY遺伝子を受け取ることになる。ファン・エネナーム氏は、これらのコピーが、染色体的には雌である動物を雄のような外見と行動（そして体重増加）にするための発生プログラムを活性化するのに十分かどうかを調べたいと考えている。彼女はこれらの次の実験を行うために、新たな助成金を申請する必要がある。

すべては純粋な研究に過ぎない。コスモのクラゲ遺伝子は、プラスミドが見つかる前からそれを保証していた。コスモもその子孫も、食糧供給に使われることは決してないだろう。彼らの物語は、カリフォルニア大学デービス校の焼却炉で終わるだろう。

次の段階がうまくいかなければ、ファン・エネナーム氏の雄だけの肉牛群の実現という目標は終わりを迎えるかもしれない。「ノックイン（ノックイン）を得るのがどれほど難しいかを考えると、このプロジェクトにもう一度手を挙げるかどうかは分かりません」と彼女は言う。

しかし、彼女の努力が分野の前進に役立たないというわけではない。オーストラリアでは、研究者たちがCrisprを使って、卵が産まれたその日にニワトリの性別を判別している。雄の胚を含む卵は、感覚を持ち鳴き声を上げるヒナに成長する前に処分できるのだ。ドイツでは、研究者たちがCrisprを使って豚の精子を編集し、子孫がすべて雌になるようにしている。雄豚は成長すると、肉に「雄臭」と呼ばれる食欲をそそる化学物質の混合物を生成するからだ。今日、農家はこれを避けるために、麻酔なしで雄豚の子豚を去勢することが多いが、ドイツ政府は最近、この残酷な慣行を禁止した（この法律は来年施行される）。また、世界各地でも、Crisprを使って動物の病気や工業型農業のその他の残酷な影響を軽減することを目指す数十のプロジェクトが進行中だ。コスモポリタンは、これらのプロジェクトすべてに多くのことを教えてくれるだろう。

2020年7月30日午後5時30分（東部標準時）更新：この記事は、Recombinetics社がブラジルで確立しようと計画していた群れは研究用であり、まだ商業目的ではなかったことを訂正し、同社の動物の一部の配列データに対するFDAの検査に関する詳細の一部を明確にするために更新されました。

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